4º Fichamento

Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina, Daniela Maira Cardozo; Guelsin  G.A.; Clementino S.L.; MeloF.C.; Braga M. A.; MoliternoR. A.; Visentainer J.E.L. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.42 no.6 Uberaba dez. 2009

  Muitos testes genéticos envolvidos em estudos de doenças humanas necessitam da utilização do DNA genômico extraído de amostras de sangue. Normalmente, o DNA genômico é obtido a partir da separação da camada de células brancas (buffy-coat) ou do sangue total.Frequentemente, ensaios genéticos envolvendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a extração de DNA, utilizam amostras de sangue coletadas com anticoagulantes³. Com isso, é possível a separação de células e plasma do sangue por centrifugação e, portanto, a retirada da camada de células nucleadas.No entanto, em muitos laboratórios, amostras de sangue coletadas para sorologia não utilizam anticoagulante e são descartadas, por serem inviáveis para os estudos genéticos, uma vez que a extração de DNA genômico destas amostras é dispendiosa e os resultados não são satisfatórios.

  Com isso, uma técnica rápida e eficiente de extração de DNA de sangue coagulado se faz necessária, uma vez que materiais biológicos que podem ser utilizados para muitos estudos genéticos são descartados rotineiramente. Além disso, esta metodologia pode representar mais uma opção para a extração de DNA de amostras cujo anticoagulante foi ineficaz.

  Amostras de 10mL de sangue coagulado de 48 indivíduos, coletadas para realização do exame de sorologia de diagnóstico do dengue pela 15ª Regional de Saúde de Maringá, Paraná, no período de março a abril de 2007, foram utilizadas neste estudo. Essas amostras foram armazenadas em tubo do tipo Falcon de 15mL em freezer -80ºC por pelo menos 3 dias. O descongelamento em banho-maria a 37ºC, por 10 minutos, foi seguido pelo banho de gelo, também, por 10 minutos. Após esse procedimento, as amostras foram homogeneizadas com pipeta Pasteur para se obter a dissolução máxima do coágulo¹ e, novamente, congeladas até o uso. Neste estudo, três metodologias de extração de DNA de buffy-coat ou sangue total foram avaliadas e modificadas para a obtenção de amostras de DNA de alta qualidade e alto rendimento a partir do sangue coagulado.

  Independente da comparação, o método de extração de DNA por EZ-DNA não foi adequado quando o material biológico de origem foi o coágulo sanguíneo. As amostras de DNA obtidas não amplificaram por nenhuma das duas metodologias de PCR testadas e o procedimento foi demorado, uma vez que foi necessário um período de 5 a 7 dias, em banho-maria, a 56ºC, para a dissolução do botão de células nucleadas na solução de EZ, o que pode ter contribuído para a degradação do DNA.

  O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração de DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue coagulado. Quarenta e oito amostras de sangue humano coagulado foram utilizadas para a extração de DNA pelo kit comercial EZ-DNA^® (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), pelo kit de coluna Neoscience^® (One Lambda Inc., San Diego, CA) e pelo método modificado de salting out. Apenas o método desalting out foi capaz de extrair altas concentrações de DNA (média, 180ng/µL), as quais foram medidas pelo detector de fluorescência Qubit^® (Invitrogen, USA). Este método permitiu a amplificação dos genes HLA (human leukocyte antigens) pela tecnologia PCR-SSO (polymerase chain reaction - specific sequence of oligonucleotides) Luminex, a qual exige DNA de boa qualidade, e de genes KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) pela técnica made in house PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), a qual demanda uma concentração específica de DNA (10ng/µL). Concluímos que a técnica de salting out modificada foi muito eficiente, simples e rápida para a extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado, com o objetivo de realizar a genotipagem de genes HLA e KIR.

P.S=De vagar e sempre,é o meu lema(to kase terminando kkkk)